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動(dòng)態(tài)濁度法的建立及測(cè)定角膜真菌感染標(biāo)本的初步研究

作者：劉宏偉，王香蘭，彭淑玲，周 毅

【摘要】 目的 建立動(dòng)態(tài)濁度法，研究角膜真菌感染的檢測(cè)。方法 分別測(cè)定葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品、內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品、真菌標(biāo)準(zhǔn)株(煙曲菌、串珠鐮刀菌和茄病鐮刀菌)及細(xì)菌標(biāo)準(zhǔn)株(綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌)，測(cè)定19例臨床標(biāo)本。

結(jié)果 葡聚糖的濃度時(shí)間曲線為雙曲線，時(shí)間反應(yīng)曲線顯示反應(yīng)速率較低。內(nèi)毒素的濃度時(shí)間曲線為直線，時(shí)間反應(yīng)曲線顯示反應(yīng)速率較高。三種真菌的濃度時(shí)間曲線和時(shí)間反應(yīng)曲線與葡聚糖的相似，革蘭陰性菌（綠膿桿菌）的濃度時(shí)間曲線和時(shí)間反應(yīng)曲線與內(nèi)毒素的相似，革蘭陽(yáng)性菌（金黃色葡萄球菌）沒(méi)有反應(yīng)。臨床19例標(biāo)本，根據(jù)其濃度時(shí)間曲線和時(shí)間反應(yīng)曲線的形態(tài)，11例確診為真菌感染，8例為革蘭陰性細(xì)菌曲線，為真菌和細(xì)菌的混合感染。
結(jié)論 動(dòng)態(tài)濁度法可用于角膜真菌感染的檢測(cè)，但對(duì)細(xì)菌-真菌混合感染不能確診。

【Abstract】 Objective To establish the turbidimetric kinetic assay and study the measurement of fungus infection in corneal specimen.Methods Glucan， endotoxin， fungus(Aspergillus fumigatus，F(xiàn)usariun　moniliforme and Fusariun solani) and bactiria(Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureaus) were measured. 19 clinic specimens were also measured.Results The concentration-time curve of glucan was hyperbola　and its time-reaction curve had low reaction rate. The concentration-time curve of endotoxin was beeline and its time-reaction curve had high reaction rate. The concentration-time curve and time-reaction curve of 3 fungi were same as that of glucan. The concentration-time curve and time-reaction curve of G- bacterium(Pseudomonas aeruginosa) were as same as that of endotoxin. The G+ bacterium(Staphylococcus aureaus) had no reaction. According the concentration-time curve and time-reaction curve， 11 specimens were diagnosed fungi and 8 specimens were co-infection of fungi and bacteria.Conclusion Fungi infection in cornea could be diagnosed by turbidimetric kinetic method. Co-infection of fungi and bacteria could not be diagnosed by this method.

【關(guān)鍵詞】 動(dòng)態(tài)濁度法；真菌；角膜；葡聚糖

【Key words】 turbidimetric kinetic method；fungus；cornea；glucan

　　角膜真菌感染的診斷較難，如不能及時(shí)治療，對(duì)患者造成損害，因此快速診斷非常必要。真菌的診斷一般采用鏡檢和培養(yǎng)的方法，鏡檢較快，但漏檢率較高，真菌培養(yǎng)的方法，檢出率較高，但時(shí)間較長(zhǎng)。我們使用鱟試劑與真菌的葡聚糖反應(yīng)的原理，建立動(dòng)態(tài)濁度法并對(duì)角膜標(biāo)本進(jìn)行真菌測(cè)定。

　　1 材料與方法

　　1.1 試劑 葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品(031222，規(guī)格：300μg/ml)，鱟試劑（批號(hào)040532，靈敏度：0.25Eu/ml）購(gòu)自廈門(mén)鱟試劑廠，內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品（批號(hào)2002-7）和檢測(cè)用水(批號(hào)2003-3)購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所。

　　1.2 儀器 細(xì)菌內(nèi)毒素測(cè)定儀、振蕩器，超聲波處理器、離心機(jī)。

　　1.3 葡聚糖和內(nèi)毒素的濃度-時(shí)間曲線

　　1.3.1 葡聚糖 將其倍比稀釋為100、50、25、12.5、6.25、3.13、1.56、0.78、0.39和 0.20μg/ml，取其200μl加入100μl鱟試劑，振蕩30s，放入細(xì)菌內(nèi)毒素測(cè)定儀測(cè)定，測(cè)定溫度為(37±1)℃。

　　1.3.2 內(nèi)毒素 將其10倍稀釋為50、5、0.5、0.05和0.005EU/ml，按上述方法測(cè)定。

　　1.4 細(xì)菌、真菌標(biāo)準(zhǔn)株的測(cè)定 細(xì)菌包括革蘭陰性菌(綠膿桿菌)和陽(yáng)性菌(金黃色葡萄球菌)，真菌包括煙曲菌、串珠鐮刀菌和茄病鐮刀菌。在培養(yǎng)基上取少量菌落，加入1ml檢測(cè)用水，超聲波處理30min，2000cpm，10min，取上清。用檢測(cè)用水將其按10倍稀釋，分別取200μl加入100μl鱟試劑，振蕩30s，細(xì)菌內(nèi)毒素測(cè)定儀測(cè)定。

　　1.5 標(biāo)本的處理 角膜標(biāo)本來(lái)自北京普仁醫(yī)院眼科，為臨床確診真菌性角膜炎后，進(jìn)行角膜移植，將角膜標(biāo)本用檢測(cè)用水沖洗后，在潔凈臺(tái)中將其剪碎，加入1ml檢測(cè)用水超聲波處理30min，2000cpm，10min，取上清備用。

　　1.6 標(biāo)本的測(cè)定和結(jié)果的確定 共檢測(cè)臨床診斷真菌的感染的角膜標(biāo)本19例，標(biāo)本處理后，用檢測(cè)用水將其按10倍稀釋8個(gè)稀釋度，分別取200μl加入100μl鱟試劑，振蕩30s，放入細(xì)菌內(nèi)毒素測(cè)定儀測(cè)定。根據(jù)標(biāo)本的濃度-時(shí)間曲線、時(shí)間反應(yīng)曲線和時(shí)間速率曲線確定。

　　1.7 細(xì)菌內(nèi)毒素測(cè)定儀的檢測(cè)指標(biāo) 內(nèi)毒素或葡聚糖與鱟試劑中的B、C或G因子反應(yīng)，形成凝膠，記錄不同濃度的內(nèi)毒素或葡聚糖在反應(yīng)過(guò)程中不同時(shí)間的光密度值，確定OD值達(dá)到0.02的反應(yīng)時(shí)間為測(cè)定反應(yīng)時(shí)間，以反應(yīng)時(shí)間為縱坐標(biāo)，以藥物濃度為橫坐標(biāo)，做圖，成為濃度時(shí)間曲線。時(shí)間反應(yīng)曲線為某一濃度的內(nèi)毒素或葡聚糖在不同時(shí)間的OD值，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，以樣品的OD值為縱坐標(biāo)，做圖。時(shí)間速率曲線為某一濃度的內(nèi)毒素或葡聚糖在不同時(shí)間的反應(yīng)速率，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，以樣品的反應(yīng)速率為縱坐標(biāo)，做圖。

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